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經(jīng)實(shí)驗優(yōu)化，最終確定甲醇/甲苯/甲酸（70:30:1）為理想溶劑體系。DESI/PI 技術(shù)創(chuàng )新的光后電離增強機制顯著(zhù)提升了多種中性物質(zhì)的成像清晰度，正離子模式下成功呈現了包括 GABA、谷氨酰胺、谷氨酸、肌酸及腺苷等在內的神經(jīng)遞質(zhì)分布特征（圖 1B-E）。以肌酸為例，其信號強度最高可增強達200倍。此外，研究還觀(guān)察到小腦和胼胝體白質(zhì)中存在十余種非極性脂質(zhì)，如豐富的膽固醇以及鞘糖脂 GalCerr（見(jiàn)圖1J和N-P)。這些發(fā)現表明，DESI/PI 技術(shù)能夠實(shí)現神經(jīng)遞質(zhì)與脂質(zhì)的同步成像，為解析二者之間的相互作用機制提供了有力支持。
圖1 通過(guò)DESI/PI和DESI分別對全腦組織切片進(jìn)行平均正離子質(zhì)譜分析（背景扣除），并展示部分代表性物質(zhì)的成像結果。
通過(guò)DESI/PI雙模式切換，在負離子模式下分別獲得了DESI質(zhì)譜圖和DESI/PI質(zhì)譜圖。研究表明，兩種模式的譜圖信息具有互補性。DESI/PI模式在成像谷氨酰胺（圖2B）、谷氨酸（圖2C）以及己糖基神經(jīng)酰胺（HexCer）（圖2I）等中性成分的同時(shí)，也顯著(zhù)提升了醚磷脂（PE-O）和磷脂酰乙醇胺（PE）脂質(zhì)（圖2E-H）的離子信號檢測（2-4倍）。然而，對于磷脂酰肌醇（PI）和硫苷脂（ST）類(lèi)脂質(zhì)（如PI(38:4)（圖2K）及ST(d18:1/C24:1)（圖2L)），DESI模式獲得的離子強度明顯高于DESI/PI模式。推測這些離子信號的衰減可能與負離子同光后電離過(guò)程產(chǎn)生的正甲苯離子發(fā)生結合有關(guān)。盡管如此，DESI/PI模式在檢測多數代謝物和脂質(zhì)類(lèi)別時(shí)仍展現出更高的靈敏度。通過(guò)兩種模式的靈活切換，可以實(shí)現樣品中多種生物分子信息的完整獲取，為全面解析其分布與相互作用提供有力支持。
圖2 通過(guò)DESI/PI和DESI負離子模式采集的腦組織切片（背景扣除）的平均質(zhì)譜圖(A)，圖中(B)展示了腦組織的最佳圖像，圖（C-M）呈現了代表性峰的質(zhì)譜圖像。
DESI/PI技術(shù)的另一重要應用在于同步可視化植物組織中的極性與非極性代謝物空間分布。本研究選取富含多種生物活性成分（如兒茶素）的鮮茶葉芽橫截面為樣本，在DESI/PI模式下，咖啡因信號強度顯著(zhù)提升達200倍。此外， DESI/PI技術(shù)成功實(shí)現了多種中性?xún)翰杷仡?lèi)黃烷-3-醇的檢測與成像，包括（-）表兒茶素（EC）、（-）表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）和（-）表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）。由于ECG和EGCG的熱不穩定性，其檢測主要基于特征碎片離子（ECG: m/z 272.07; EGCG: m/z 289.07）。這些結果有力證明，DESI/PI技術(shù)能夠有效克服低極性化合物（如兒茶素）在常規DESI中離子化效率低的問(wèn)題，為全面解析植物復雜代謝物的空間分布提供了強大工具。
圖3 茶樹(shù)兩個(gè)連續新鮮葉芽橫截面的平均質(zhì)譜圖（背景扣除），(A)茶樹(shù)葉芽組織的最佳圖像。（B-F）DESI/PI 獲得的代表性峰的質(zhì)譜圖像。（G-H）DESI獲得的代表性峰的質(zhì)譜圖像。
中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)國家同步輻射實(shí)驗室潘洋團隊在《Talanta》期刊發(fā)表題為“Cholesterol was identified as a biomarker in human melanocytic nevi using DESI and DESI/PI mass spectrometry imaging”的研究論文，采用解吸電噴霧光后電離（DESI/PI）技術(shù)，建立了一種原位跨極性檢測的空間代謝組學(xué)方法，顯著(zhù)提升了非極性脂質(zhì)在黑素細胞痣組織中的檢出。能在分子層面更精準地區分健康正常組織與黑素細胞痣。結合多變量統計分析及免疫組化檢測，進(jìn)一步證實(shí)膽固醇是診斷黑素細胞痣的潛在生物標志物。（文章鏈接： https://doi.org/10.1016/j.talanta.2021.122380）
黑色素細胞痣是最人類(lèi)常見(jiàn)的良性皮膚病變，由于其顯著(zhù)增加患者罹患惡性黑色素瘤風(fēng)險，需手術(shù)切除。然而，現有治療手段（激光治療、手術(shù)）面臨復發(fā)挑戰，根源在于術(shù)中難以實(shí)時(shí)確認是否徹底清除病灶?，F有診斷方法存在明顯不足：金標準的組織病理學(xué)高度依賴(lài)經(jīng)驗且難區分良惡性；影像學(xué)技術(shù)（皮膚鏡等）靈敏度/特異性有限，缺乏分子層面的精準識別能力。質(zhì)譜成像（MSI）技術(shù)，特別是無(wú)需基質(zhì)操作便捷的解吸電噴霧電離（DESI），能提供分子空間分布信息，但存在關(guān)鍵局限：對生物樣本中關(guān)鍵的非極性化合物（如膽固醇、脂質(zhì)）電離效率較低，限制了全面分析。為突破此瓶頸，本研究引入創(chuàng )新的解吸電噴霧電離/后光離子化（DESI/PI ）技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)后光離子化組件對DESI脫附物進(jìn)行高效二次電離，顯著(zhù)提升非極性物信號強度，實(shí)現對極性與非極性成分的同步、全面成像分析，為術(shù)中實(shí)時(shí)精準切除、降低復發(fā)風(fēng)險提供強大的分子診斷新工具。
收集九例不同部位黑色素細胞痣術(shù)中標本，制成冰凍組織切片。采用解吸電噴霧光后電離質(zhì)譜成像技術(shù)（DESI/PI-MSI），采集上述組織中內源性代謝物及其空間分布信息；對相鄰切片進(jìn)行HE染色，采用MassImager質(zhì)譜成像數據處理軟件，使質(zhì)譜成像圖與HE染色圖匹配重合，提取不同組織內源性代謝物輪廓信息。對采集數據進(jìn)行PCA分析，同時(shí)采用免疫組化方法檢測膽固醇相關(guān)蛋白表達，揭示膽固醇在黑色素瘤組織聚集原因。
基于DESI/PI光后電離增強非極性物質(zhì)電離效率的技術(shù)優(yōu)勢，本研究檢測到大量非極性成分的質(zhì)譜信號。通過(guò)雙模式切換生成互補質(zhì)譜圖像，成功鑒定并可視化了多達118種分子（正離子模式下64種，負離子模式下54種），并獲得黑色素細胞痣與正常組織中極性物質(zhì)和非極性物質(zhì)的代表性質(zhì)譜峰。實(shí)驗中直觀(guān)呈現多種生物標志物的區域特異性分布信息（圖1C-P)。例如，L-肉堿、S1P、膽固醇、PC34：1和PC38：4主要分布在痣區，而TG54：6、利多卡因及其他生化物質(zhì)則在正常區域占主導地位。S1P、膽固醇、PC34：1和PC38：4 等物質(zhì)的空間分布特征與H&E染色圖像高度吻合（圖1B)，且具有統計學(xué)顯著(zhù)差異（P < 0.0001）。
圖1 (A)黑色素細胞痣組織與正常組織在正離子模式下的區域特異性質(zhì)譜圖。DESI/PI（紅色曲線(xiàn)）與 DESI（黑色曲線(xiàn)）的平均質(zhì)譜圖疊加顯示。(B)樣本組織的H&E染色圖像，（C-K）主要分布于黑色素細胞 痣的脂質(zhì)質(zhì)譜圖像。（L-O）正常組織中脂質(zhì)分布的質(zhì)譜圖像，以及(P)利多卡因的質(zhì)譜圖像
通過(guò)分析九份臨床標本，本研究提取了黑色素細胞痣與正常組織的質(zhì)譜數據集（m/z 250-950）。通過(guò)二維主成分分析（PC1和PC2）可清晰區分九份臨床人體皮膚組織中的黑色素細胞痣與正常組織。前兩個(gè)主成分分別解釋了65%和10%的方差。圖2B展示了前兩個(gè)主成分的載荷數據散點(diǎn)圖，以識別區分黑色素細胞痣與正常組織的關(guān)鍵變量。負載PC1的物種（m/z 339.24、339.28、577.52和603.53）主要分布于正常組織中，而正載PC1的變量則代表在黑色素細胞痣中更為豐富的物種。位于m/z 369.35附近的變量源自膽固醇，其在PC1上的正載值最高，表明膽固醇是黑色素細胞痣中最重要的生物標志物之一。
圖2 標本1樣本載玻片中黑色素細胞痣和正常組織區域的S1P (A)、膽固醇(B)、PC 34：1 (C)、PC 38：4 (D)、花生四烯酸(E)和PE O-36：5 (F)的箱形圖
為了解膽固醇在黑素細胞痣組織中積累的原因，研究選取了兩種與膽固醇密切相關(guān)的酶——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）和轉運蛋白（TSPO）作為染色觀(guān)察指標。HMGCR作為膽固醇生物合成的關(guān)鍵限速酶，通過(guò)下調HMGCR基因表達來(lái)調控膽固醇合成。TSPO是轉運蛋白，在膽固醇向線(xiàn)粒體的轉運過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且該蛋白還參與類(lèi)固醇生物合成的調控。研究結果顯示，黑色素細胞痣中HMGCR（圖3C)和TSPO（圖3D)的表達水平顯著(zhù)高于正常組織，這與質(zhì)譜圖像中膽固醇的分布情況高度吻合。因此，推測黑色素細胞痣區域膽固醇蓄積的原因可能是：HMGCR酶合成更多膽固醇后，通過(guò)TSPO酶轉運至線(xiàn)粒體促進(jìn)黑色素細胞增殖（圖3E)。雖然膽固醇在調控人類(lèi)黑色素細胞生成中的作用尚不明確，但其可作為術(shù)中診斷黑色素細胞痣的生物標志物。
圖3 樣本1中膽固醇生物合成與轉運過(guò)程中膽固醇及酶的原位可視化。(A)膽固醇的質(zhì)譜圖像。(B)組織切片的H&E染色圖像。(C)黑色素細胞痣與正常組織區域中HMG-CoA還原酶的表達情況。(D) TSPO在黑色素細胞痣與正常組織中的表達情況。(E)黑色素細胞膽固醇蓄積的簡(jiǎn)易機制示意圖。
本研究采用DESI/PI質(zhì)譜成像技術(shù)，對常規手術(shù)中采集的九例人體標本進(jìn)行極性/非極性脂質(zhì)綜合成像分析，旨在明確正常組織中的黑色素細胞痣特征并尋找潛在脂質(zhì)生物標志物，通過(guò)DESI/PI和DESI雙模式切換，成功可視化多種脂質(zhì)成分，并發(fā)現膽固醇、鞘氨醇一磷酸（S1P）、磷脂酰膽堿 （PCs）、磷脂酰乙醇胺（PE）、脂肪酸（FAs）、甘油三酯（MAGs）及二酰甘油（DAGs）等特定脂質(zhì)可有效區分黑色素細胞痣與正常組織。通過(guò)箱線(xiàn)圖和雙尾t檢驗分析，這些脂質(zhì)在黑色素細胞痣與正常組織中均呈現統計學(xué)顯著(zhù)差異。對多例標本數據進(jìn)行主成分分析（PCA）后發(fā)現，膽固醇是黑色素細胞痣中最顯著(zhù)的生物標志物。免疫組化染色顯示，HMGCR和TSPO這兩種顯著(zhù)上調的酶促反應，合理解釋了膽固醇的富集現象。本研究證實(shí)，DESI/PI質(zhì)譜成像技術(shù)在皮膚病變及黑色素瘤等疾病的術(shù)中診斷中具有重要價(jià)值。
中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)國家同步輻射實(shí)驗室潘洋團隊在分析化學(xué)一區《Analytical Chemistry》期刊發(fā)表封面文章，題為“Enhanced Coverage and Sensitivity of Imprint DESI Mass Spectrometry Imaging for Plant Leaf Metabolites by Post photoionization”，首創(chuàng )PTFE印跡-DESI/PI聯(lián)用技術(shù)，實(shí)現植物代謝物跨極性原位同步成像，成功解析萜類(lèi)、兒茶素和內酯類(lèi)非極性化合物空間動(dòng)態(tài)，為植物代謝研究提供高靈敏、多極性覆蓋的分析新范式。（文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03329）
植物作為食品制藥領(lǐng)域的關(guān)鍵資源，其代謝物的譜型分析與空間定位對闡明生物合成、生理調控及環(huán)境互作機制至關(guān)重要。然而植物代謝物成像卻面臨三重技術(shù)壁壘：角質(zhì)層和表皮蠟的屏障天然阻隔軟電離技術(shù)（MALDI/DESI）導致深層代謝物捕獲失??；傳統穿透方案中激光燒蝕造成大部分熱敏物質(zhì)降解，而化學(xué)預處理（氯仿清洗）破壞空間真實(shí)性并誘發(fā)褐變；即使改良溶劑體系，對葉片代謝物仍存在漏檢，且DESI對非極性物電離效率較低。本研究通過(guò)PTFE轉印-DESI/PI聯(lián)用技術(shù)實(shí)現雙重突破——多孔惰性介質(zhì)完整轉移代謝物規避角質(zhì)屏障，光后電離使中性分子信號提升百倍級，最終同步捕獲紫杉醇等非極性物與兒茶素生物合成網(wǎng)絡(luò )空間圖譜，為植物代謝通路研究提供有力支持。
收集綠茶、鼠尾草葉和銀杏葉三種植物樣本，采用多孔聚四氟乙烯（PTFE）片進(jìn)行壓印處理并光學(xué)成像，采用DESI/PI裝置對樣本進(jìn)行數據采集，原始數據經(jīng)MSiReader軟件整合為離子分布圖像?；衔锿ㄟ^(guò)精確質(zhì)荷比（誤差<10ppm）、同位素分布及串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，對比人類(lèi)代謝組及脂質(zhì)數據庫完成歸屬，基于KEGG京都基因與基因組百科全書(shū)和Metabo Analyst解析生物合成途徑。
鼠尾草屬植物富含具有顯著(zhù)生物活性（如抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化）的萜類(lèi)化合物。DESI/PI的光后電離機制顯著(zhù)增強了此類(lèi)物質(zhì)的檢測靈敏度。正離子模式下，該技術(shù)不僅基本覆蓋了DESI可檢出的化合物譜系，更額外識別并成像了14種已鑒定代謝物（圖1B）。其中，二萜類(lèi)化合物卡諾醇、卡諾酸及表異松醇/異松醇廣泛分布于葉片（葉脈除外）；而具有抗癌、抗炎特性的三萜類(lèi)物質(zhì)熊果酸/齊墩果酸則富集于葉緣區域；中性脂質(zhì)DAG（36：1）主要定位于葉脈。在負離子模式下，DESI/PI對相同質(zhì)譜峰的檢測靈敏度較DESI提升了20至40倍。 綜上，本研究證明DESI/PI質(zhì)譜成像系統作為一種高靈敏度技術(shù)，在正負離子模式下均能高效捕獲多種植物代謝物的空間分布信息。
圖1 (A)鼠尾草葉片經(jīng)DESI/PI印跡法（紅色）和DESI印跡法（黑色）檢測的平均正離子質(zhì)譜圖（背景扣除）。(B)DESI/PI印跡法與DESI正離子模式下檢測化合物的維恩圖。(C)鼠尾草葉片中部分代表性化合物經(jīng)DESI/PI印跡法與DESI檢測的質(zhì)譜圖像。
銀杏葉中產(chǎn)生多種具有顯著(zhù)藥理活性的生物活性代謝物，其提取物有潛力治療與阿爾茨海默病、中風(fēng)和正常衰老相關(guān)的某些神經(jīng)系統后遺癥。如圖2A所示，通過(guò)印跡DESI/PI技術(shù)對銀杏葉進(jìn)行平均質(zhì)譜分析時(shí)，其光后電離機制成功捕獲谷氨酸、乙氧基香豆素及山柰酚/木犀草素等11類(lèi)DESI完全漏檢的關(guān)鍵代謝物（包括黃酮類(lèi)與萜內酯），同時(shí)將膽堿等共有化合物的檢測靈敏度提升10–20倍?？臻g分布解析層面，DESI/PI精準揭示黃酮類(lèi)物質(zhì)在葉片上部的梯度富集與葉柄處的最低蓄積規律，并鎖定銀杏內酯C17:1等生物活性烷基酚類(lèi)在分泌腔的特異點(diǎn)狀分布——該分布模式與葉肉組織中均勻擴散的黃酮苷形成鮮明互補，從分子層面驗證植物次生代謝產(chǎn)物的細胞區室化存儲機制。技術(shù)性能上，負離子模式下DESI/PI對銀杏內酯的響應強度系統性提高10–20倍，并同步實(shí)現極性黃酮苷與非極性萜內酯的原位跨極性成像，徹底突破傳統DESI的檢測盲區與電離偏好限制，為解析植物代謝網(wǎng)絡(luò )的空間異質(zhì)性提供強大的工具支撐。
圖2 (A)通過(guò)印跡DESI/PI（紅色）和DESI（黑色）檢測的銀杏葉正離子質(zhì)譜平均圖（背景扣除）。(B)印跡DESI/PI與DESI在正離子模式下檢測化合物的維恩圖。(C)銀杏葉中部分代表性化合物的印跡DESI/PI與DESI質(zhì)譜圖像。(D)m/z 287.06（紅色）和m/z 375.29（綠色）處離子的RGB共定位圖像。
DESI/PI技術(shù)在綠茶鮮葉代謝成像中展現出突破性?xún)?yōu)勢：其創(chuàng )新的光后電離機制使咖啡因檢測靈敏度較傳統DESI提升61倍（圖3B），清晰揭示了咖啡因沿葉脈富集并向葉肉延伸的合成梯度，精準驗證茶堿合成酶（TCS1）的嫩葉特異性表達規律。在多酚代謝網(wǎng)絡(luò )解析中，該技術(shù)成功捕獲兒茶素生物合成通路（含EC/EGCG等6類(lèi)化合物），通過(guò)皮爾遜相關(guān)性分析鎖定沒(méi)食子酸及葡萄糖沒(méi)食子酸等關(guān)鍵中間體在葉脈區域的特異富集（圖3E），并基于空間分布特征證實(shí)兒茶素沒(méi)食子?；揎椀拿复俜磻窂剑▓D3F）。在廣譜檢測層面，DESI/PI同步實(shí)現了茶氨酸于葉柄樞紐區的運輸通道可視化及谷氨酸全域分布成像，尤其在負離子模式下將代謝物響應強度系統性提升10-20倍，徹底解決了傳統DESI對兒茶素合成關(guān)鍵分子（如沒(méi)食子酸）的漏檢問(wèn)題。這種跨極性（正/負離子模式）、跨代謝通路的同步成像能力，確立了DESI/PI在解析植物代謝時(shí)空動(dòng)態(tài)中的不可替代性。
圖3 (A)印跡DESI/PI正離子模式下檢測到的茶葉代表性代謝物質(zhì)譜圖像。(B)印跡DESI/PI（紅色）與DESI（黑色）對茶葉進(jìn)行背景扣除后的平均正離子質(zhì)譜圖。(C)印跡DESI檢測到的茶葉代表性代謝物質(zhì)譜圖像。(D)茶葉中脈及葉片區域EC/C、EGC/ GC、ECG/CG和GCG/EGCG的箱線(xiàn)圖及t檢驗結果。****表示P值< 0.0001。(E)通過(guò)印跡DESI/PI正離子模式獲得的茶葉25種已 鑒定代謝物空間分布的皮爾遜相關(guān)系數熱圖。(F)主要兒茶素的生物合成途徑，其中檢測到的代謝物以紅色高亮顯示
本研究開(kāi)發(fā)了基于PTFE印跡轉移與DESI/PI質(zhì)譜聯(lián)用的植物代謝物原位分析方法。該方法通過(guò)PTFE印跡完整保留組織代謝物空間分布，結合DESI/PI技術(shù)進(jìn)行解吸電離協(xié)同：通過(guò)引入光后電離，DESI/PI顯著(zhù)提升極性至非極性代謝物的電離效率。以鼠尾草、銀杏及茶葉為模型進(jìn)行成像分析，結果表明：正離子模式下除覆蓋絕大多數DESI檢出化合物外，DESI/PI可顯著(zhù)檢出萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等次生代謝物；負離子模式中PI輔助使代謝物信號強度提升十倍以上。該技術(shù)成功解析鮮茶葉兒茶素生物合成網(wǎng)絡(luò )的空間構象，證實(shí)DESI/PI兼具廣譜覆蓋性、高靈敏度及跨極性檢測能力，為植物代謝原位可視化提供可靠方法學(xué)支撐。
