Spatiotemporal transcriptome and metabolome landscapes of cotton fiber during initiation and early development

Xuwu Sun , Aizhi Qin, Xingxing Wang, Xiaoyang Ge, Zhixin Liu, Chenxi Guo, Xiaole Yu, Xianliang Zhang, Yao Lu, Jincheng Yang, Jiuming He, Yaping Zhou, Yumeng Liu, Mengke Hu, Hao Liu, Zihao Zhao, Guanjing Hu, Wei Li, Xinshan Zang, Shuai Dai, Susu Sun, Lenin Yong-Villalobos,  Luis Herrera-Estrella ,  Lam-Son Phan Tran & Xiongfeng Ma

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：15.7

DOI: 10.1038/s41467-025-55869-z

研究背景：

棉花作為全球重要經(jīng)濟作物，其纖維發(fā)育經(jīng)歷起始、伸長(cháng)、加厚和成熟四階段，受轉錄因子、激素及代謝物協(xié)同調控，調控纖維細胞發(fā)育的過(guò)程已被廣泛研究，然而，在纖維發(fā)育的早期階段的時(shí)空轉錄組和代謝組仍然在很大程度上未知。本研究創(chuàng )新性整合空間轉錄組（ST）、單細胞轉錄組（scRNA-seq）和空間代謝組（SM）技術(shù)，系統分析棉花纖維細胞發(fā)育早期階段的轉錄組和代謝組的動(dòng)態(tài)變化，鑒定關(guān)鍵調控基因（如GhBEE3）及代謝物，并通過(guò)功能實(shí)驗驗證其作用。研究成果不僅深化了對棉花纖維發(fā)育機制的理解，更為作物多組學(xué)研究提供了方法論范例。

技術(shù)方法：空間轉錄組學(xué)、空間代謝組學(xué)、單細胞轉錄組學(xué)、空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧質(zhì)譜成像（AFADESI-MSI）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）、mRNA原位雜交技術(shù)

研究亮點(diǎn)：

1、整合空間轉錄組、單細胞轉錄組、空間代謝組鑒定了可能調控纖維細胞早期發(fā)育的關(guān)鍵基因（如DOX2/KCS19.4、BEE3和HOS3.7）和代謝物（如亞油酸、精胺、亞精胺和α-亞麻酸）；

2、發(fā)現GhBEE3在纖維細胞起始中起重要作用，過(guò)表達GhBEE3促進(jìn)纖維細胞的起始和伸長(cháng)，而RNAi抑制則減少纖維細胞的數量；

3、創(chuàng )建了交互式網(wǎng)站（https://cotton.cricaas.com.cn/ovule/）用于可視化棉花纖維細胞的時(shí)空基因表達模式。

研究思路：

研究采用統一空間分辨率的多組學(xué)策略，將空間轉錄組（ST）、單細胞轉錄組（scRNA-seq）和AFADESI空間代謝組（SM）相結合。選取?1.5至5-DPA 的棉鈴和胚珠為材料，ST繪制全組織基因表達地圖并鑒定標記基因，scRNA-seq解析細胞類(lèi)型及發(fā)育軌跡，SM描繪代謝物空間分布并篩選關(guān)鍵代謝物。隨后，將基因與代謝物數據按代謝通路整合分析，識別在特定細胞和階段共同高表達的調控因子。最后，通過(guò)原位雜交驗證空間轉錄組結果，并對代表性基因開(kāi)展功能驗證，構建棉花纖維早期發(fā)育的多組學(xué)時(shí)空圖譜。

圖1 棉花纖維發(fā)育圖譜的分子研究方法

研究結果：

1.棉鈴的空間轉錄組檢測分析

研究利用ST技術(shù)對?1.5-DPA至5-DPA的棉鈴樣本進(jìn)行測序，涵蓋6個(gè)發(fā)育階段，并在0 DPA與5 DPA設置生物重復，共8個(gè)樣本。HE染色結果顯示，棉纖維細胞在0-DPA開(kāi)始分化，3-DPA時(shí)自外種皮伸出，5-DPA進(jìn)一步伸長(cháng)（圖2a）。經(jīng)組織優(yōu)化實(shí)驗確定最佳滲透條件為24分鐘，并在此條件下完成反轉錄、建庫和測序，獲得約5萬(wàn)基因的時(shí)空表達譜，每個(gè)像素點(diǎn)捕獲1–10個(gè)細胞，每個(gè)點(diǎn)含有3177–5556個(gè)表達基因和極少數線(xiàn)粒體基因（線(xiàn)粒體基因主要來(lái)源于細胞核線(xiàn)粒體RNA，主要在細胞代謝活躍或死亡時(shí)會(huì )上升，可用來(lái)評估細胞的活性和組織完整性）。UMAP分析將6個(gè)樣本劃分為19個(gè)細胞簇（圖2b），并映射回組織切片定位，發(fā)現“中皮/隔膜細胞”簇（1、2、6、9、14）廣泛存在于各階段，而“纖維細胞”簇（3、10、19）特異存在于3 DPA和5 DPA（圖2c）。差異表達分析鑒定出各簇的標記基因，如外種皮簇的SBT4.14、GH3.6.2、GASA14.1，以及纖維細胞簇的KCS19.4、HOS3.7、bZIP43.11。GO富集結果顯示，外種皮簇與“果實(shí)發(fā)育”和“種子發(fā)育”相關(guān)，內種皮簇與“氮化合物生物合成”相關(guān)，纖維細胞簇則與“種子毛狀體分化”相關(guān)（圖2d、e）。

圖2 棉纖維發(fā)育六個(gè)階段的時(shí)空基因表達

2.棉花胚珠中基因表達的ScRNA-seq分析

   作者對?1.5、?1、0及1-DPA四個(gè)發(fā)育階段進(jìn)行scRNA-seq測序，共獲得2.97萬(wàn)余個(gè)高質(zhì)量細胞，單細胞平均表達基因數為1022-2501。與對應時(shí)間點(diǎn)的ST數據進(jìn)行比較，結果顯示兩者高度一致，驗證了數據的可靠性（圖3a）。UMAP分析將細胞劃分為16個(gè)簇，并結合ST結果進(jìn)行注釋?zhuān)b定出如OPR2同源基因Gh_A05G105700、YUC10.4同源基因Gh_D08G075000等與激素合成相關(guān)的代表性基因（圖3c,d）。GO富集分析表明，“外珠被”與“珠心”簇顯著(zhù)富集脂肪酸合成及胚后發(fā)育相關(guān)基因，“外珠被”部分簇則與表皮毛狀體分化和伸長(cháng)密切相關(guān)。進(jìn)一步的Monocle擬時(shí)序分析重建了細胞發(fā)育軌跡，將其分為5個(gè)狀態(tài)、3個(gè)分支，其中?1.5-DPA外珠被細胞集中于早期，0與11-DPA外珠被細胞集中于晚期，反映了不同細胞類(lèi)型在發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)分布（圖4a-c）?；虮磉_趨勢可歸納為三個(gè)模塊：早期高表達后下降型、逐漸升高型及中期達峰型，其中編碼休克蛋白（HSP）的基因HSP70.20在中期顯著(zhù)上調，印證其在維持纖維起始與伸長(cháng)細胞穩態(tài)中的關(guān)鍵作用（圖4d）。

圖3 1.5-DPA~1-DPA棉花胚珠的單細胞轉錄組分析

圖4 1.5-DPA~1-DPA所有棉花胚珠樣品的擬時(shí)序分析

3.棉鈴的空間代謝組檢測分析

為深入解析纖維發(fā)育的代謝機制，作者采用AFADESI-MSI 技術(shù)，對?1.5 至 5 DPA 棉鈴分階段進(jìn)行高靈敏度、廣覆蓋的成像分析（圖5a）。研究鑒定了多個(gè)在棉纖維早期發(fā)育過(guò)程中起重要作用的代謝物，這些代謝物主要包括脂肪酸及其衍生物（如亞油酸、α-亞麻酸）、胺類(lèi)（如亞精胺、精胺）、氨基酸、肽類(lèi)及類(lèi)似物（如L-精氨酸）。此外，琥珀酸、膽堿、PA-34:1、PA-34:2、PE-44:10、PE-36:4、PC-33:4等也在早期發(fā)育的胚珠中高表達，而在其他組織中的表達相對較低（圖5a），這些特定代謝物主要參與了以下代謝途徑：亞油酸代謝、角質(zhì)層、木栓層和蠟的生物合成、α-亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝、β-丙氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝。通過(guò)AFADESI-MSI技術(shù)對不同發(fā)育階段（從-1.5 DPA到5 DPA）胚珠中這些特定代謝物的積累動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析（圖5b），發(fā)現了一些顯著(zhù)的變化趨勢：如貝亨酸、亞油酸、PE-44:10、亞精胺、膽堿的表達豐度從-1.5 DPA到5 DPA逐漸減少，表明這些代謝物可能與纖維的分化啟動(dòng)密切相關(guān)。相反，α-亞麻酸、組氨酰胺、油酸、PA-34:1的表達豐度從-1.5 DPA到5 DPA逐漸增加，表明這些代謝物可能與纖維的早期伸長(cháng)密切相關(guān)。進(jìn)一步對一些代表性代謝物進(jìn)行了空間分布特征的成像分析（圖5c），二十二烷二酸、亞油酸、α-亞麻酸、油酸的空間分布特征顯示出它們在胚珠不同區域的特異性表達模式。例如，α-亞麻酸在3 DPA和5 DPA的胚珠中表現出較高的表達水平，這與之前的研究結果一致，表明α-亞麻酸在促進(jìn)棉纖維伸長(cháng)方面起著(zhù)重要作用。

圖5 正負離子模式下棉胚珠中-1.5-DPA~5-DPA的特異性表達代謝物

4.轉錄組和代謝組數據的綜合分析

作者綜合分析棉花早期纖維的 ST 與 SM 數據，利用 AFADESI 空間代謝組學(xué)在纖維早期發(fā)育中鑒定出多種顯著(zhù)差異代謝物（L-精氨酸、氧戊二酸、L-天冬氨酸、α-亞麻酸、亞油酸、精胺、亞精胺等）?？梢暬Y果顯示，LCAT4 或 PLA2-ALPHA 在胚珠高表達，催化磷脂酰膽堿生成 α-亞麻酸；磷脂酰膽堿、α-亞麻酸、13(S)-HPOT 等關(guān)鍵代謝物在胚珠異位富集。α-亞麻酸可轉化為茉莉酸 JA，其相關(guān)基因在 3、5-DPA 核細胞與纖維細胞中高表達，與胚珠中 α-亞麻酸的高積累相一致，凸顯其在早期纖維伸長(cháng)中的核心作用。ST 分析進(jìn)一步發(fā)現，DOX2 在 3-DPA 纖維細胞中高表達并參與該代謝途徑，提示其潛在調控功能。

圖6 ST中α-亞麻酸代謝途徑及代謝酶相關(guān)基因的綜合分析

5.通過(guò)原位雜交進(jìn)行標記基因的分析

通過(guò)對棉鈴發(fā)育早期的ST分析，在外皮細胞中鑒定出標記基因DOX2、SBT4.14、GH3.6.2和SWEET15（圖2d）。為了驗證聚集細胞簇在ST分析中的分類(lèi)可靠性，作者采用ISH方法分析了這四種被皮細胞標記物在棉鈴發(fā)育早期的表達模式。ISH分析顯示，DOX2和SBT4.14在-1-DPA外皮細胞高表達，GH3.6.2強烈表達在0-DPA外皮細胞，SWEET15在3-DPA外皮細胞強烈表達（圖7b），這與空間轉錄組組結果一致。

圖7 RNA原位雜交顯示的外皮細胞標記基因的時(shí)空表達模式

6.GhBEE3促進(jìn)棉纖維細胞的起始

已有研究表明油菜素內酯（BRs）可促進(jìn)纖維起始與伸長(cháng)。作者在棉花胚胎中鑒定到 BR 信號轉導相關(guān)基因 GhBEE3 高表達，推測其參與早期纖維發(fā)育。以中棉 24（ZM24）為背景，構建 GhBEE3 過(guò)表達（OE）與 RNAi 株系，并在 ?1-DPA 至 3 -DPA 棉鈴中觀(guān)察纖維發(fā)育（T3 代）。SEM 結果顯示，?1-DPA 時(shí)各組均僅有少量突出的纖維細胞；0-DPA 起，OE株系纖維細胞數量顯著(zhù)高于對照，而 RNAi 株系顯著(zhù)減少。1- DPA 時(shí)差異進(jìn)一步擴大，至 2–3 DPA，OE 株系纖維細胞伸長(cháng)明顯且密度更高，RNAi 株系則纖維稀疏，提示 GhBEE3 在纖維起始與早期伸長(cháng)中具有促進(jìn)作用。

圖8 GhBEE3正向調控棉纖維的起始作用

研究結論：

該研究采用多時(shí)間點(diǎn)（DPA）采樣策略，整合空間代謝組（AFADESI-MSI）、單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）和空間轉錄組（ST）等多組學(xué)技術(shù)，系統解析了棉花纖維形成與早期伸長(cháng)階段代謝物的空間分布及基因調控特征。研究者成功揭示了此過(guò)程中轉錄組與代謝組的時(shí)空動(dòng)態(tài)。同時(shí)，研究構建了交互式網(wǎng)站展示相關(guān)數據，為單細胞水平研究棉花纖維發(fā)育提供了重要資源。此外，該研究不僅為同行開(kāi)展類(lèi)似工作提供了可行方案，更為加速單細胞空間多組學(xué)技術(shù)在多種作物中的應用建立了方法論模型。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-55869-z